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微囊化乳酸菌抗逆性试验研究
发布日期:2013-12-19 15:08:30   浏览次数:1632
 

本试验研究了微囊化乳酸菌对高温高湿、胃酸和胆盐的耐受性。研究表明经过90℃高温、2分钟,乳酸菌的存活率为95%;经过90℃高温高湿、60秒,乳酸菌的存活率为80%;当胃液的ph值为2、经过120分钟,乳酸菌的存活率为83%;当胆盐浓度0.5%,经过3小时后乳酸菌的存活率为85%。本试验表明微囊化乳酸菌的抗逆性有较大提高。

关键词:微囊化乳酸菌;抗逆性

乳酸菌是最早公布的2种饲料级可直接添加的微生态菌种之一。乳酸菌是动物肠道中的长期定居者[1],以乳酸菌为主的兼性厌氧菌和厌氧菌占消化道总菌数的90%以上[2],在维持肠道菌群平衡方面发挥着重要作用,能够提高饲料转化率、促进动物生长、提高动物免疫功能。但由于乳酸菌的抗逆性差,活菌在保存、制粒和通过胃肠时的不利环境时容易导致乳酸菌活性降低。对乳酸菌用耐高温高湿的材料进行微囊包被后,可以抵抗饲料加工过程中高温、高湿等不良环境的影响,同时包被材质属于肠溶性包被材质,能够防止胃酸的破坏。

本试验考察微囊化乳酸菌对高温、高湿、胃酸和胆盐等不良环境的影响,为其在生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种

乳酸菌由北京京牧康贝技术有限公司提供,粪肠球菌≥100亿CFU/克。

1.2 高温耐受性试验

以无菌操作称取固体乳酸菌样品1.0g,放入含有10粒无菌玻璃珠的无菌18×180试管中,将其放入已设定好温度的烘箱中(不塞棉塞),待温度显示为要求温度时开始计时,恒温,结束后迅速取出,塞棉塞,继续做稀释倾注计数实验。

1.3 高温高湿耐受性试验

以无菌操作称取固体乳酸菌样品4.0g,放入干净干燥培养皿中,将其漂浮于已设定好温度的水浴锅水面上,不盖皿盖,盖上水浴锅的盖,水浴锅中插入一支温度计作为温度监测用,待温度显示为要求温度时开始计时,恒温,结束后迅速取出,继续做稀释倾注计数实验。

1.4 胃酸耐受性试验

1.4.1 胃液的配置

1.4.1.1 PBS缓冲液

氯化钠 8g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O 3.63g
磷酸二氢钾 0.24g
纯净水 1000mL

1.4.1.2 调整pH值 用6mol/L的HCl调以上PBS缓冲液pH至2.0、3.0和4.0,分装30ml至150mL含有玻璃珠的无菌三角瓶中,包扎,121℃灭菌20min,在无菌室以1g/100ml比例加胃蛋白酶。

1.4.2 耐胃酸检测方法

准确称取0.30g待测固体样品置于以上不同pH值的溶液中,37℃培养 2 h,进行稀释平板菌落培养计数。

1.5 胆盐耐受性试验

1.5.1 胆盐溶液的制备


1.5.1.1 PBS缓冲液

氯化钠 8g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O 3.63g
磷酸二氢钾 0.24g
纯净水 1000mL
用6mol/L的HCl调pH至7.4,分装30mL至150mL无菌三角瓶中,包扎,121℃灭菌20min,备用。

1.5.1.2 5%胆盐溶液

准确称取5.0g胆盐,用100mL纯净水溶解,分装至250mL无菌三角瓶中,121℃灭菌20min。

1.5.1.3 含胆盐的0.15%、0.30%、0.50%PBS液

在30mL的pH7.4的PBS溶液中加入0.9mL、1.8ml、3.0ml的5%胆盐溶液,涡旋混匀,此为含胆盐0.15%、0.30%、0.50%的PBS溶液。

1.5.2 耐胆盐检测方法

准确称取0.30g待测固体样品置于以上不同pH值的溶液中,37℃培养 3 h,进行稀释平板菌落培养计数。

2 结果

2.1 微囊化乳酸菌的耐高温高湿特性

高温、高湿对微囊化乳酸菌存活率的影响如表1所示。本试验人工模拟高温制粒的高温及高温高湿环境,以考察微囊化乳酸菌对高温高湿环境的耐受性。研究表明经过90℃高温、2分钟,乳酸菌的存活率为95%,经过90℃高温高湿、60秒,乳酸菌的存活率仍为80%。

表1 高温、高湿对微囊化乳酸菌存活率的影响

处理

处理时间

处理前活菌含量Cfu/g

处理后活菌含量Cfu/g

存活率

80℃高温

2 min

1.03×1010

1.01×1010

98%

85℃高温

2 min

1.03×1010

0.99×1010

96%

90℃高温

2 min

1.03×1010

0.98×1010

95%

80℃高温高湿

60 s

1.03×1010

0.93×1010

90%

85℃高温高湿

60 s

1.03×1010

0.88×1010

85%

90℃高温高湿

60 s

1.03×1010

0.82×1010

80%


2.2 微囊化乳酸菌的耐胃酸特性

胃酸对微囊化乳酸菌存活率的影响如表2所示。食物在畜禽动物胃里的停留时间一般为1-2小时,本试验人工模拟胃液环境,当胃液的ph值为4,经过120分钟,乳酸菌的存活率为95%;当胃液的ph值为3,经过120分钟,乳酸菌的存活率为86%;当胃液的ph值为2、经过120分钟,乳酸菌的存活率仍为83%。

表2 胃酸对微囊化乳酸菌存活率的影响

PH值

处理时间

PH 2.0

PH 3.0

PH 4.0

活菌数cfu/mL

存活率

活菌数cfu/mL

存活率

活菌数cfu/mL

存活率

0 min

1.01×1010

1.04×1010

1.02×1010

60 min

0.92×1010

91%

0.96×1010

92%

0.97×1010

95%

90 min

0.87×1010

86%

0.95×1010

91%

0.95×1010

93%

120 min

0.84×1010

83%

0.89×1010

86%

0.97×1010

95%

2.3 微囊化乳酸菌的耐胆盐特性

胆盐对微囊化乳酸菌存活率的影响如表3所示。由表3可见,随着胆盐浓度的升高,时间的延长,乳酸菌的存活率不断降低,当胆盐浓度0.3%、经过3小时后乳酸菌的存活率为89%,当胆盐浓度0.5%,经过3小时后乳酸菌的存活率仍为85%。

表3 胆盐对微囊化乳酸菌存活率的影响

pH值

时间

0.15%

0.3%

0.5%

活菌数cfu/mL

存活率

活菌数>cfu/mL

存活率

活菌数cfu/mL

存活率

0h

1.00×1010

1.03×1010

1.01×1010

1h

1.00×1010

100%

0.98×1010

95%

0.95×1010

94%

2h

0.98×1010

98%

0.95×1010

92%

0.90×1010

89%

3h

0.97×1010

97%

0.92×1010

89%

0.86×1010

85%

3 讨论

乳酸菌是动物肠道中的常住菌,具有特异性的粘附素可以定植于肠粘膜表面,从而有效的发挥其作用。动物消化道中的乳酸菌主要分乳杆菌和肠球菌[3]。乳酸菌不形成芽孢,抗性较差,容易在饲料加工过程、胃液中被破坏。微囊化乳酸菌能够提高菌种耐受高温、胃酸、胆酸盐的能力,保证益生菌能够进入肠道并发挥其益生作用。

动物纯净胃液的 pH 值一般为 0.5~1.5,分泌旺盛时为 1或低于1。进食后胃内的pH 保持在 2~2.5 左右[4]。饲用乳酸菌必须能够经受胃中的低PH值,才能保证有足够数量的活菌到达肠道。胆盐是乳酸菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素[5],对细胞膜有很强的破坏力。

本试验研究表明当胃液的ph值为2、经过120分钟,乳酸菌的存活率为83%,当胆盐浓度0.5%,经过3小时后乳酸菌的存活率仍为85%。本试验表明微囊化乳酸菌具有较好的耐酸和耐胆盐能力,可以通过动物的胃和十二指肠并保持菌种的数量和活力,能够应用于畜禽动物的生产。

乳酸菌在制作粉料、颗粒料时,饲料加工的调制温度一般在65~90℃,饲用乳酸菌必须具备一定的耐高温或耐高温高湿能力,才能耐受饲料加工。本试验研究表明经过90℃高温、2分钟,微囊化乳酸菌的存活率仍为95%,经过90℃高温高湿、60秒,微囊化乳酸菌的存活率仍为80%,研究表明该微囊化乳酸菌适用于饲料加工生产。

4 结论

微囊化乳酸菌有较强的耐酸、耐胆盐特性,在通过动物胃肠道时能够保持菌种的活性,同时具有较强的耐高温、高湿能力,非常适用于饲料加工生产。

参考文献:

[1]刘丽英,张日俊.乳酸菌类微生态制剂及其微囊化的研究进展[J].中国畜牧杂志,2004,40(4):40-41.

[2]张日俊.我国动物微生态产业存在的问题与发展对策[J].新饲料,2009,10:8-13.

[3]张刚.乳酸细菌-基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社,2007:14.

[4]吕利军.菊粉制备和乳酸菌微囊化包被的研究.内蒙古农业大学硕士论文[D],2008.

[5]黄沧海,谯仕彦,李德发,等.仔猪益生乳酸杆菌菌种抗逆性选育的研究[J].粮食与饲料工业,2004,12:44-45.

   
 

 
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