本试验研究了微囊化乳酸菌对高温高湿、胃酸和胆盐的耐受性。研究表明经过90℃高温、2分钟，乳酸菌的存活率为95%；经过90℃高温高湿、60秒，乳酸菌的存活率为80%；当胃液的ph值为2、经过120分钟，乳酸菌的存活率为83%；当胆盐浓度0.5%，经过3小时后乳酸菌的存活率为85%。本试验表明微囊化乳酸菌的抗逆性有较大提高。
关键词：微囊化乳酸菌；抗逆性
乳酸菌是最早公布的2种饲料级可直接添加的微生态菌种之一。乳酸菌是动物肠道中的长期定居者[1],以乳酸菌为主的兼性厌氧菌和厌氧菌占消化道总菌数的90%以上[2]，在维持肠道菌群平衡方面发挥着重要作用，能够提高饲料转化率、促进动物生长、提高动物免疫功能。但由于乳酸菌的抗逆性差，活菌在保存、制粒和通过胃肠时的不利环境时容易导致乳酸菌活性降低。对乳酸菌用耐高温高湿的材料进行微囊包被后，可以抵抗饲料加工过程中高温、高湿等不良环境的影响，同时包被材质属于肠溶性包被材质，能够防止胃酸的破坏。
本试验考察微囊化乳酸菌对高温、高湿、胃酸和胆盐等不良环境的影响，为其在生产中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 菌种
乳酸菌由北京京牧康贝技术有限公司提供，粪肠球菌≥100亿CFU/克。
1.2 高温耐受性试验
以无菌操作称取固体乳酸菌样品1.0g，放入含有10粒无菌玻璃珠的无菌18×180试管中，将其放入已设定好温度的烘箱中（不塞棉塞），待温度显示为要求温度时开始计时，恒温，结束后迅速取出，塞棉塞，继续做稀释倾注计数实验。
1.3 高温高湿耐受性试验
以无菌操作称取固体乳酸菌样品4.0g，放入干净干燥培养皿中，将其漂浮于已设定好温度的水浴锅水面上，不盖皿盖，盖上水浴锅的盖，水浴锅中插入一支温度计作为温度监测用，待温度显示为要求温度时开始计时，恒温，结束后迅速取出，继续做稀释倾注计数实验。
1.4 胃酸耐受性试验
1.4.1 胃液的配置
1.4.1.1 PBS缓冲液
| 氯化钠 |
8g |
| 氯化钾 |
0.2g |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） |
3.63g |
| 磷酸二氢钾 |
0.24g |
| 纯净水 |
1000mL |
1.4.1.2 调整pH值 用6mol/L的HCl调以上PBS缓冲液pH至2.0、3.0和4.0，分装30ml至150mL含有玻璃珠的无菌三角瓶中，包扎，121℃灭菌20min，在无菌室以1g/100ml比例加胃蛋白酶。
1.4.2 耐胃酸检测方法
准确称取0.30g待测固体样品置于以上不同pH值的溶液中，37℃培养 2 h，进行稀释平板菌落培养计数。
1.5 胆盐耐受性试验
1.5.1 胆盐溶液的制备
1.5.1.1 PBS缓冲液
| 氯化钠 |
8g |
| 氯化钾 |
0.2g |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） |
3.63g |
| 磷酸二氢钾 |
0.24g |
| 纯净水 |
1000mL |
| 用6mol/L的HCl调pH至7.4，分装30mL至150mL无菌三角瓶中，包扎，121℃灭菌20min，备用。 |
1.5.1.2 5%胆盐溶液
准确称取5.0g胆盐，用100mL纯净水溶解，分装至250mL无菌三角瓶中，121℃灭菌20min。
1.5.1.3 含胆盐的0.15%、0.30%、0.50%PBS液
在30mL的pH7.4的PBS溶液中加入0.9mL、1.8ml、3.0ml的5%胆盐溶液，涡旋混匀，此为含胆盐0.15%、0.30%、0.50%的PBS溶液。
1.5.2 耐胆盐检测方法
准确称取0.30g待测固体样品置于以上不同pH值的溶液中，37℃培养 3 h，进行稀释平板菌落培养计数。
2 结果
2.1 微囊化乳酸菌的耐高温高湿特性
高温、高湿对微囊化乳酸菌存活率的影响如表1所示。本试验人工模拟高温制粒的高温及高温高湿环境，以考察微囊化乳酸菌对高温高湿环境的耐受性。研究表明经过90℃高温、2分钟，乳酸菌的存活率为95%，经过90℃高温高湿、60秒，乳酸菌的存活率仍为80%。
表1 高温、高湿对微囊化乳酸菌存活率的影响
|
处理 |
处理时间 |
处理前活菌含量Cfu/g |
处理后活菌含量Cfu/g |
存活率 |
|
80℃高温 |
2 min |
1.03×1010 |
1.01×1010 |
98% |
|
85℃高温 |
2 min |
1.03×1010 |
0.99×1010 |
96% |
|
90℃高温 |
2 min |
1.03×1010 |
0.98×1010 |
95% |
|
80℃高温高湿 |
60 s |
1.03×1010 |
0.93×1010 |
90% |
|
85℃高温高湿 |
60 s |
1.03×1010 |
0.88×1010 |
85% |
|
90℃高温高湿 |
60 s |
1.03×1010 |
0.82×1010 |
80% |
2.2 微囊化乳酸菌的耐胃酸特性
胃酸对微囊化乳酸菌存活率的影响如表2所示。食物在畜禽动物胃里的停留时间一般为1-2小时，本试验人工模拟胃液环境，当胃液的ph值为4，经过120分钟，乳酸菌的存活率为95%；当胃液的ph值为3，经过120分钟，乳酸菌的存活率为86%；当胃液的ph值为2、经过120分钟，乳酸菌的存活率仍为83%。
表2 胃酸对微囊化乳酸菌存活率的影响
|
PH值
处理时间 |
PH 2.0 |
PH 3.0 |
PH 4.0 |
|
活菌数cfu/mL |
存活率 |
活菌数cfu/mL |
存活率 |
活菌数cfu/mL |
存活率 |
| 0 min |
1.01×1010 |
|
1.04×1010 |
|
1.02×1010 |
|
| 60 min |
0.92×1010 |
91% |
0.96×1010 |
92% |
0.97×1010 |
95% |
|
90 min |
0.87×1010 |
86% |
0.95×1010 |
91% |
0.95×1010 |
93% |
|
120 min |
0.84×1010 |
83% |
0.89×1010 |
86% |
0.97×1010 |
95% | 2.3 微囊化乳酸菌的耐胆盐特性
胆盐对微囊化乳酸菌存活率的影响如表3所示。由表3可见，随着胆盐浓度的升高，时间的延长，乳酸菌的存活率不断降低，当胆盐浓度0.3%、经过3小时后乳酸菌的存活率为89%，当胆盐浓度0.5%，经过3小时后乳酸菌的存活率仍为85%。
表3 胆盐对微囊化乳酸菌存活率的影响
|
pH值
时间 |
0.15% |
0.3% |
0.5% |
|
活菌数cfu/mL |
存活率 |
活菌数>cfu/mL |
存活率 |
活菌数cfu/mL |
存活率 |
|
0h |
1.00×1010 |
|
1.03×1010 |
|
1.01×1010 |
|
|
1h |
1.00×1010 |
100% |
0.98×1010 |
95% |
0.95×1010 |
94% |
|
2h |
0.98×1010 |
98% |
0.95×1010 |
92% |
0.90×1010 |
89% |
|
3h |
0.97×1010 |
97% |
0.92×1010 |
89% |
0.86×1010 |
85% | 3 讨论
乳酸菌是动物肠道中的常住菌，具有特异性的粘附素可以定植于肠粘膜表面，从而有效的发挥其作用。动物消化道中的乳酸菌主要分乳杆菌和肠球菌[3]。乳酸菌不形成芽孢,抗性较差，容易在饲料加工过程、胃液中被破坏。微囊化乳酸菌能够提高菌种耐受高温、胃酸、胆酸盐的能力,保证益生菌能够进入肠道并发挥其益生作用。
动物纯净胃液的 pH 值一般为 0.5～1.5，分泌旺盛时为 1或低于1。进食后胃内的pH 保持在 2～2.5 左右[4]。饲用乳酸菌必须能够经受胃中的低PH值，才能保证有足够数量的活菌到达肠道。胆盐是乳酸菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素[5],对细胞膜有很强的破坏力。
本试验研究表明当胃液的ph值为2、经过120分钟，乳酸菌的存活率为83%，当胆盐浓度0.5%，经过3小时后乳酸菌的存活率仍为85%。本试验表明微囊化乳酸菌具有较好的耐酸和耐胆盐能力，可以通过动物的胃和十二指肠并保持菌种的数量和活力，能够应用于畜禽动物的生产。
乳酸菌在制作粉料、颗粒料时，饲料加工的调制温度一般在65～90℃，饲用乳酸菌必须具备一定的耐高温或耐高温高湿能力,才能耐受饲料加工。本试验研究表明经过90℃高温、2分钟，微囊化乳酸菌的存活率仍为95%，经过90℃高温高湿、60秒，微囊化乳酸菌的存活率仍为80%，研究表明该微囊化乳酸菌适用于饲料加工生产。
4 结论
微囊化乳酸菌有较强的耐酸、耐胆盐特性，在通过动物胃肠道时能够保持菌种的活性，同时具有较强的耐高温、高湿能力，非常适用于饲料加工生产。
参考文献：
[1]刘丽英,张日俊.乳酸菌类微生态制剂及其微囊化的研究进展[J].中国畜牧杂志,2004,40(4):40-41.
[2]张日俊.我国动物微生态产业存在的问题与发展对策[J].新饲料,2009,10:8-13.
[3]张刚.乳酸细菌-基础、技术和应用[M].北京:化学工业出版社,2007:14.
[4]吕利军.菊粉制备和乳酸菌微囊化包被的研究.内蒙古农业大学硕士论文[D],2008.
[5]黄沧海,谯仕彦,李德发,等.仔猪益生乳酸杆菌菌种抗逆性选育的研究[J].粮食与饲料工业,2004,12:44-45.
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