摘要；运用载片观察法和菌落平板培养法对本实验室分离到的丝状真菌Mars进行了培养观察，并与标准菌球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428进行比较，初步鉴定Mars可能属于白僵菌属 (Beauveria)。采用明胶琼脂平板法测定了Mars和3.4428的胞外蛋白酶，结果表明Mars的胞外蛋白酶酶活略小于3.4428。另外，实验测定了Mars和3.4428的产孢量，发现Mars的产孢量小于3.4428。并进行了室内感染松毛虫毒力的比较，结果显示3.4428的毒力强于Mars。

     关键词：丝状真菌；观察鉴定；胞外蛋白酶；产孢量

     本实验室分离到一株丝状真菌Mars，它在Mas培养基上能产生明显的溶钙圈，在牛奶培养基中培养能导致酸凝，并且使培养基由白色变为紫红色。该菌株在多种培养基上培养都没有发现有性孢子，初步鉴定是一种半知菌。本实验对该菌株进行了形态观察，并与购于中科院的标准菌株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428相对比，以确定该菌株的准确分类地位。另外，根据球孢白僵菌所具有的一些生理生化特征，本实验对Mars的产孢量，胞外蛋白酶的活力及毒力等特性进行了初步研究。

    1 材料与方法

    1.1 供试菌株

     Mars菌株，保存在PDA斜面上，由山西大学微生物实验室提供。

     标准菌株球孢白僵菌（Beauveria bassiana）3.4428购于中国科学院北京微生物研究所，保存在查氏斜面上。

     1.2 试剂

     Hgcl2，吐温-100，磷酸缓冲溶液等。

     1.3仪器

     高压蒸气灭菌锅，超净工作台，恒温培养箱，电子显微镜，电子天平等。

     1.4 培养基

     共使用下列培养基[1~2]：马铃薯培养基（PDA），添加了蛋白胨的马铃薯培养基（PPDA），查氏培养基（CA培养基），明胶琼脂培养基：平板由1﹪的明胶和1.5﹪的琼脂配成。

     1.5实验方法

     1.5.1固体平板培养法

     从PDA斜面和CA斜面上分别挑取少量孢子接种到PDA、CA、PPDA平板上，25℃黑暗培养观察菌落形态。

     1.5.2载片观察法[1]

     将圆形滤纸铺于培养皿的底部，其上放一U形玻棒及盖玻片和载玻片各一片，盖好培养皿盖，灭菌；用无菌玻棒直接蘸取已融化的固体培养基滴于培养皿中载玻片的中央；用接种环取少量孢子接种于载玻片上培养基小块的四周，加上盖玻片，并略向下轻压；为防止培养过程中培养基干燥，可于培养皿中的滤纸圆片上滴加无菌的20%甘油液3-4毫升，盖好皿盖；将盖好的培养皿置适宜的温度下培养，定期取出，观察显微结构。             

     1.5.3胞外蛋白酶的测定（使用明胶琼脂平板法[3]）

     平板由1﹪的明胶和1.5﹪的琼脂配成，各待试菌株配成1×108孢子/mL的孢子悬液，用微量取样器取25μL点滴在平板中央。每待试菌株6次重复，25℃黑暗培养三天，用15%的HgCl2（溶于2mol/L的盐酸）溶液处理,待菌落周围显现清晰的透明环后，倒去HgCl2，用直尺测量纵横两个方向的透明环直径和菌落直径，以透明环和菌落直径平均值之比作为胞外蛋白酶产酶量的指标。

     1.5.4产孢量的测定[4]

     分别将Mars和3.4428接种于PDA培养基、PPDA培养基、CA培养基上，25℃黑暗培养10d后，每个处理设置3个重复，在菌落核心至1/2处用直径为4.5mm打孔器打孔取样,置入盛有10mL 0.1﹪吐温水的500mL三角瓶中，手摇震动10-15min。用两层纱布过滤后得孢子悬液，用无菌滴管滴一滴于血细胞计数板上，小心加放盖玻片，避免产生气泡，在显微镜下直接计数。从血细胞计数板上每个小方格（体积1/5，000，000mL）中的孢子数可进一步计算出3个重复单位面积产孢量的平均值。计算公式如下：

     样品孢子数/mm2=A／5×25×104×稀释倍数∕15.9

     1.5.4毒力测定[4]

     配制2×108个/mL,2×107个/mL的两种不同浓度的孢子悬液，挑取大小均匀、健康活泼的供试松毛虫虫体，取新鲜的松针孢子液中浸5—10s，取出停留2—3s，连同供试虫（100头）一并放入干净玻璃制养虫缸（直径10cm，高15cm）中，用白纱窗布罩住缸口，每个处理设三次重复，空白对照不喷任何物质，注意喷洒前先将菌液摇匀，后置入恒温培养箱中在25℃下黑暗培养，处理后3d更换新鲜松针，以后每2d更换1次松针，并在培养箱中放入湿棉花以保持湿度，至少保证湿度在75%左右，每2d定时检查幼虫的死亡情况，同时拣出死虫，PDA平板保湿培养以确诊死因。在除去虫粪，计算校正死亡率，并求死亡中时LT50。

     2  结果与分析

     2.1  载片观察法结果及分析

     将接有Mars与3.4428孢子的载玻片培养7d后，从培养箱中取出，将载玻片直接置于显微镜上观察。具体形态特征[5－9]描述如下：

     Mars：营养菌丝无色，粗1.2~3.0μm，分生孢子梗多着生于营养菌丝上，产孢细胞常浓密簇生于菌丝或泡囊上，有时可多达十几个，极少数单生，产孢细胞基部多为球形，近球形，少柱形，个别产孢细胞基部特化为较长的细丝。颈部明显延长成粗1μm，长达14μm的产孢轴。轴上具小齿突，呈膝状弯曲（“之”字形弯曲），培养后期，在低倍镜下常见球型的密集孢子头（由泡囊，产孢细胞和分生孢子组成），分生孢子透明，光滑，多为亚卵型和椭圆型。（见图1、图2）。

     Beauveria bassiana 3.4428：营养菌丝无色，粗1.2~3.0μm,分生孢子梗多着生于营养菌丝上，产孢细胞常簇生于菌丝或泡囊上，最多可达7个，少数单生，产孢细胞基部多为球形，近球形，少柱形，产孢轴较长，可达17μm。轴上具小齿突，呈膝状弯曲（“之”字形弯曲），培养后期，在低倍镜下常见球型的密集孢子头（由泡囊，产孢细胞和分生孢子组成），分生孢子透明，光滑，多为亚卵型和椭圆型，个别为长柱型。（见图3、图4）。a