摘要： 本文主要就我们近年来应用PCR为主的核糖体RNA基因方法对不同生态环境下微生物多样性的新研究及新菌种的鉴定以及这些微生物体外发酵特性等方面研究结果及进展情况作了介绍．同时对关于胃肠道真菌的研究也作了概述。

     关键调：PCR；核糖体RNA；微生物；真菌

     很多动物的消化系统为各种微生物提供适宜的生活环境。反过来，胃肠道微生物对宿主动物有两方面的作用：一是它们帮助消化食物，为动物提供各种营养物质；二是它们起着益生素作用，调控胃肠道微生物区系本身之间的平衡，保证动物的健康。对于前者。虽然已有很多研究，但是人们并不完全清楚这些微生物的作用机理。对于后者的研究较少，但是人们已开始认识到益生索的重要性，并在饲料中添加外源益生素。有报道认为．某些外源的非降解寡糖通过调控肠道微生物区系的平衡对动物起保健作用。目前，我们对外源益生素的作用机理并不十分清楚，对动物本身体内的微生物的调控作用更不了解。这其中一个重要的原因是我们缺乏对这类微生物的充分认识。

     动物胃肠道微生物区系是非常复杂和多样化的。目前常用的传统的培养方法只能培养很少数的微生物，由此迄今只有很少数的微生物得到描述。但并不能代表胃肠道中整个微生物区系的活性。近年发展起来的以PCR为主的核糖体RNA基因方法，已被成功地用于不同生态环境下的微生物多样性的研究及新菌种的鉴定。我们采用这种技术，研究不同日粮和应激条件下，动物胃肠道微生物种类的变化。另一方面。根据这些微生物体外发酵特性，研究胃肠道微生物整体发酵活性的变化。下面就这两方面．介绍我们的研究结果及进展，同时介绍关于胃肠道厌氧真菌的研究。

     1用分子技术研究动物胃肠道微生物区系

     近年来．以核糖体RNA为主的分子技术发展迅速。核糖体RNA基因的保守区域可以用作合成DNA的引物。对RNA基因的变化区域进行PCR扩增反应。根据核糖体RNA基因序列的变化区分不同的微生物。最新的技术，如变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳法，具有基因序列专一性，可以直接用以检测微生物区系的组成。由PCR扩增后得到的长度相同、而碱基对组成不一的DNA片段，经这两种梯度凝胶电泳后得到分离。我们从猪粪便中提取总DNA，并以此为模板。经PCR反应扩增细菌的16S核糖体RNA的V6至V8区域的基因片段。然后。经变性梯度凝胶电泳，分析不同处理的PCR扩增片段，比较细菌种类变化。另一方面。我们对代表性样品DNA进行克隆及基因序列分析，以揭示￡要细菌的种类。通过这种基因分析及下面将讨论的体外发酵活性的测定，我们希望找出微生物区系的组成和这些微生物体外发酵活性之问的关系，探讨饲料成分和环境应激对这种关系的影响。此项研究正在进行中。对胃肠道厌氧真菌，我们采用了18S核糖体RNA的基因序列分析法对菌株进行鉴定。我fflX,t来自不同国家、地区，不同动物的厌氧真菌菌株进行DNA提取，对这些真菌的】8s核糖体RNA基因簇的内转子一区及其相邻的基因序列，经PCR扩噌后进行分析，确定新菌株与已知菌株的进化关系，从而确定它们的分类地位。另外，我们利用内转子基因序列进行了分子杂交试验。以望发展属专一性的探针技术。但是这种探针技术能否直接用于检测动物体内厌氧真菌，还须大量研究。

     2 胃肠道微生物的体外发酵

     近年来，人们根据胃肠道微生物发酵产气原理．用累积产气最方法来研究饲料体外发酵特性．并以此对动物饲料进行评估。英国草原与环境研究所研制r专门用于测定产气量的气压转换器。这种转换器操作方便，结果可靠。我们利用气压转换器．并以瘤胃液为接种物，分析不同饲料的体外发酵特性，研究不同Et粮条件下反刍动物瘤胃液在体外发酵的能力。另外，采用转换器测定产气量的方法。我们对50个厌氧真菌菌株进行体外发酵研究。结果表明。厌氧真菌发酵时累积产气量与其降解植物片段的能力成正比关系。因此．我们将累积产气量方法用于高效厌氧真菌的筛选。结果显示，来自主食粗饲料的反刍动物的厌氧真菌比来自主食精料或叶类组织的真菌具有较高的发酵活性。

     3胃肠道厌氧真菌

     1975年。Orpin首次发现了瘤胃厌氧真菌。于是打破了真菌需要氧的传统说法。以前，瘤胃厌氧真菌被误认为是原虫。在研究瘤胃微生物时．人们往往果用经纱布或尼龙网过滤后的瘤胃液。这样正好把粘在固体残渣上的真菌滤掉了。因此，看到的只是有鞭毛的细胞。这些细胞被误认为原虫。除在瘤胃外，厌氧真菌普遍存在于反刍动物和单胃草食动物胃肠道各器官中。另外，这些动物的粪便中都存在厌氧真莲。而且．来自日晒或烘干后的粪便的厌氧真菌能耐氧。因此，从粪便中分离真菌为厌氧真菌的收集和普查工作提供了方便且成长低的新途径。我们利用干燥粪便的方法。从不同国家和地区、不同动物粪便中收集了50多个菌株。以麦秸为发酵底物，用累积产气量方法，对这些菌种进行筛选。这些厌氧真菌在体外能降解35％到60％的麦秸干物质。同一属的，来自不同动物的菌株，其降解麦秸的能力不同。我国土种山羊粪便中分离到的菌株与其它菌株比较．具有较高的降解麦秸的能力。

     在实验室条件下，人们往往用封闭的培养瓶培养厌氧真菌。这种条件下，真菌的适宜的底物浓度不超过1％，否则。其发酵产物会抑制真菌的生长。在它们的自然生活条件——动物胃肠道中，这些真菌的发酵产物，部分被肠道壁吸收，部分在消化道中流走，因此，不存在发酵产物的累积。所以，如在瘤胃中，干物质浓度达12％也不影响饲料的降解消化率。在我们设计的流体培养条件下，当麦秸干物质浓度为10％时，厌氧真菌仍能降解达60％的干物质；而同一试验中，在同一千物质浓度下，生长在封闭的培养瓶中的同种厌氧真菌，只能降解12％的干物质。这种流体培养技术同时也提高胞外木聚糖酶、木糖糖苷酸酶及纤维素酶的产量。

     4研究方向

     胃肠道微生物不仅能帮助动物消化饲料。提供养分，而且通过对饲料，特别是非降解寡糖的发酵，保护动物的健康。目前，我们对这些胃肠道微生物的作用还不很清楚。其中重要的原因，就是缺乏对胃肠道微生物多样性的了解。最近，以核糖体RNA基因分析为主的分子技术，已成功地用于多种生态条件下特别是人胃肠道中微生物组成的直接检测；鉴定新的菌株；寻找新的益生素菌株。这些技术同样可以用于动物体内微生物区系的研究，以便搞清某些饲料成分，如寡糖、外源益生素等影响动物生产和健康的作用机理；同时。寻找在动物体内本身起益生素作用的微生物菌株。

     很多研究表明，厌氧真菌具有很强的降解不同植物大小片段的能力。具有高效降解能力的菌株有望在动物饲料生产上开发利用。这些高效菌株也可以用来克服目前的秸秆问题。目前，因技术条件的限制．我国大量成堆的秸秆，特别是稻草和麦秸被焚烧，造成环境污染。如果这些大量的秸秆能通过厌氧真菌发酵，变成有用的工业产品，如动物饲料，那么既变废为宝，又减少了环境污染。