目前微生态制剂迅猛发展，乳酸菌是微生态制剂中应用最为广泛 ，效果较好的一类。美国FDA批准用作直接饲喂的微生物已有 43种，其 中乳酸菌 28 种，我国农业部允许使用的饲料微生物添加剂有 12 种，其中乳酸菌7种。双歧杆菌、乳酸杆菌是肠道最重要也是最具代表性的生理性细菌，它们对宿主发挥生物屏障  、营养 J、免疫  J、抗肿瘤  等生理作用。粘附是微生物与宿主相互关系的先决条件之一，是定植的第一步，是其发挥生物屏障功能的基础。双歧杆菌和乳酸杆菌作为益生菌吸附于黏膜表面可以延长自身作用于宿主的时间。目前，关于乳酸杆菌和双歧杆菌研究主要集 中在其粘附机制的研究。研究益生菌的自身粘附及其对病原菌粘附的抑制作用，不仅能丰富微生态学理论，而且有助于进一步探讨益生菌的生物屏障机制，对益生菌制剂的研究与开发也具有非常重要的理论意义。本文将对乳酸菌的粘附素和粘附素受体、粘附特点、影响粘附的因素、研究粘附的方法、粘附的生物学效应等方面做一综述。

1 粘附过程

细菌对黏膜上皮细胞的粘附基本分为两阶段：第一阶段为聚集和吸附阶段，是细菌接近黏膜上皮细胞表面并发生非特异性结合，仅仅是物理学上的接触 ，此阶段是可逆的。细菌吸附上皮细胞后可随即进入第二阶段。粘附的第二阶段为特异性粘附阶段，是细菌与黏膜上皮细胞上特异性受体发生特异性结合的过程，受体与配体间通过化学键相结合。

2 粘附素和粘附素受体

参与粘附的物质多种多样，直接参与粘附的有位于细菌表面和(或)培养上清中的粘附素与位于宿主细胞表面的粘附素受体。

2．1 粘附素 粘附素是存在于微生物的菌毛、细胞壁、外膜蛋白、鞭毛、荚膜及小丝状体的一类与微生物的粘附密切相关 的特殊物质，可能是蛋白质、多肽、糖蛋白、糖脂和多糖或单糖，是一种具有多种结构和功能的多样化分子。目前，关于乳酸杆菌和双歧杆菌的粘附素研究主要有三种学说：脂磷壁酸(1ipoteichoicacid，LTA)说、细菌表面粘附蛋 白说、细菌表面分子说。

2．1．1 脂磷壁酸(LTA)说 乳酸杆菌和双歧杆菌是革兰阳性细菌，细胞壁中含有丰富 的脂磷壁酸(LTA)。许多研究表明 LTA在乳酸杆菌和双歧杆菌的粘附中有重要作用。1985年，CAMP等用Hc油酸标记 1株双歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifi—dum)的脂磷壁酸(LTA)，然后用酚提取 LTA，研究其对人肠道上皮细胞的粘附，发现双歧杆菌的 LTA对肠上皮细胞的粘附是特异的和可逆的，并且具有浓度及时间依赖性。研究还发现这种粘附作用受白蛋白的抑制，LTA经碱处理脱脂后丧失粘附力，由此推测 LTA作为粘附素介导双歧杆菌与肠上皮细胞的粘附。GRANATO等  用 Ljohnsonii IJa1免疫小鼠，并提纯其抗体，发现该抗体能特异性的和 L johnsoniiIJa1表面的LTA发生作用。进一步研究发现纯化的LTA可抑制细菌对 Caco一2细胞(人结肠癌细胞系，其结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞)的粘附，并且这种抑制作用具有浓度依赖性，该结果提示乳酸杆菌对细胞的粘附是由 LTA介导的。LTA为两性分子，一端类脂结合在胞浆膜上，另一端穿过细胞壁到达细胞表面。LTA的游离类脂在细菌表面形成微毛结构，构成细菌粘附过程中的配体部位。LTA的低等电点特性，使得细菌表面分布了大量的负电荷，这种静电的连接作用提供了细菌与受体细胞粘附的基础。

2．1．2 细菌表面粘附蛋白说 在乳酸菌中存在许多不同的介导粘附的表面蛋白，研究较为清楚的是一些乳酸杆菌的s层表面蛋白，s层蛋白由单一蛋白质或糖蛋白组成，相对分子质量约为(40～200)×10 。大量的研究 表明，s层蛋 白可 能与细 菌的粘 附有关]。郑跃杰等 刮用激光共聚式细胞仪研究了FITC标记的双歧杆菌对体外培养肠上皮细胞的粘附。结果表明，双歧杆菌的粘附素是一种蛋白质，由细菌分泌至培养液中。为进一步研究双歧杆菌粘附素他们采用硫酸铵沉淀，凝胶过滤和离子交换法，从双歧杆菌耗尽培养液上清中纯化出一种相对分子质量为 16KDa的蛋白质，经包括粘附细胞仪等多种技术鉴定，这种蛋白质能介导双歧杆菌并阻断致病性大肠埃希菌(EPEC)和产肠毒性大肠埃希菌(ETEC)对肠上皮细胞的粘附 17j。1993年，BERNET等¨ 研究了双歧杆菌对体外培养肠上皮细胞系 Caco一2和 HT29MTX的粘附，发现双歧杆菌对这两种细胞系的粘附不依赖于钙离子；在使用胰蛋白酶处理后发现双歧杆菌的粘附力明显下降；用新鲜细菌培养液或磷酸盐缓冲液代替耗尽培养液上清悬浮细菌后 ，双歧杆菌的粘附力也明显降低，因此他认为双歧杆菌粘附素可能是细菌表面的一种蛋白质物质，这种物质存在于双歧杆菌的培养上清中。REID等 9J研究发现，3株分离于生殖道的乳酸杆菌在 PBS中对生殖道上皮有粘附作用，但这种粘附作用都是对胰蛋白敏感的，表明其粘附素可能是蛋白质。从双歧杆菌的培养上清液分离出一种分子量为52 KDa的蛋白质，此蛋白质能抑制 EPEC对神经节四酰基鞘氨醇 GA1的粘附。提示双歧杆菌存在分泌型的蛋白质粘附素成分 2 。从发酵乳酸杆菌 104R培养上清和细胞壁表面提取一种29 KDa粘附促进蛋白，这种蛋白质与发酵乳酸杆菌104R粘附到仔猪小肠黏膜及胃黏膜有关  。所以蛋白质可能是乳酸杆菌和双歧杆菌粘附素的主要成分之一。

2．1．3 细菌表面分子说 邓一平等  采用 ELISA阻断法研究双歧杆菌及表面分子脂磷壁酸(LTA)、完整肽聚糖(WPG)、多糖(PS)对猪胃黏膜糖蛋白的粘附作用，以了解双歧杆菌在定植过程中参与粘附作用的主要表面分子。结果表明 LTA、WPG的粘附作用明显，PS粘附作用很弱，粘附随着菌液浓度的增高而增强。在双歧杆菌的定植粘附机制中，起主要作用的是该菌菌体表面分子 LTA、WPG；粘附与菌液浓度相关。高碘酸处理可降低 L plantarum Lp6的粘附性，说明细菌表面的碳水化合物参与了粘附 J。双歧杆菌菌悬液用 65℃水浴 30 min灭活处理后，灭活的双歧杆菌与活菌均能粘附于肠上皮细胞周围，热处理对细胞壁蛋白和脂磷壁酸都会造成严重的破坏。影响其粘附性能，推断细菌表面存在除蛋白质和 LTA外的其他粘附作用的分子  。

2．2 粘附素受体 宿主细胞必须具备相应的粘附素受体，才能完成两者间的粘附过程。宿主细胞表面粘附素受体的类型和数量决定着细菌能否粘附于宿主细胞表面以及粘附位置和数量。目前对双歧杆菌、乳酸杆菌粘附素受体的了解还很少，尚不能确定其成分。FUJIWARA等  从 B．1ongum SBT2928的培养上清中分离 的蛋白质片断能抑制 ETEC对其受体GA1的粘附，也能抑制 ETEC对人小肠上皮细胞系HCT一8的粘附，且这种抑制作用具有浓度依赖效应因而可推测双歧杆菌与病原菌识别的是肠上皮细胞GA1上的不同位点，双歧杆菌对病原菌的抑制只是在空间上阻碍了病原菌对宿主细胞的粘附，而并非是阻断了病原菌的粘附素受体，双歧杆菌的粘附素受体可能是糖脂类物质。郑跃杰等 引用胰蛋白酶和过碘酸钠处理 Lovo细胞后 ，发现其与双歧杆菌的粘附明显降低，从而证实双歧杆菌粘附素可能识别肠上皮细胞膜上特异的糖蛋白。MUKAI等  发现，L．re —ten JCM1081和 TM105可以与幽门螺杆菌(Helico—bacter pylon，H p  )受体分子 asialo—GM1和硫苷脂(suffatide)粘附，以阻止 H  fo 与这类受体的结合，因此它们可能与  pylon有共同的特异性受体，提示

糖脂或硫苷脂类分子可能是乳酸杆菌粘附素受体之一。

3 乳酸菌粘附的特点

3．1  粘附具有种属特异性 一般乳酸杆菌和双歧杆菌的粘附存在种属特异性，不同的种或亚种其粘附力不同，BERNET等_l 发现 l3株人源双歧杆菌对 Ca—CO一2细胞的粘附里存在较大差异，粘附力最强的是B．breve 4、B．infant~1和 3株从人体新分离的菌株， 且不同菌株 抑制大肠埃希 菌和沙 门菌粘 附 HT一29MTX的能力也不同。同种不同的分离株其粘附性能也相差很大。TUOMOLA等  采用革兰染色和放射性同位素标记的方法检测了 l2株乳酸杆菌对 ca—CO一2细胞的粘附，发现不同菌株粘附力有很大差异， L．casei(Fyos)的粘附力最强，达到14％，L．casei讹r． rhamnosus粘附力最弱，只有 4％。分离 自正常人不同部位的菌群对泌尿生殖道上皮细胞的粘附能力不同；分离 自健康成年人和健康老年人的双歧杆菌对肠黏膜的粘附力也不同，分离自成年人的菌株的粘附力比分离自老年人的菌株粘附力更强  。

3．2 粘附具有宿主特异性 双歧杆菌和乳酸杆菌的粘附还具有宿主特异性，从人粪便中分离出的双歧杆菌对人肠黏膜的粘附能力明显强于其对牛肠黏膜的粘附能力  。从啮齿动物分离的乳酸杆菌菌株只能粘附定植于啮齿动物的消化道上皮，从家禽分离的乳酸杆菌菌株只能粘附定植于家禽消化道上上皮，说明乳酸杆菌的粘附具有较强的宿主特异性 ¨。但也有相反的观点，RINKINEN等  进行了乳酸菌对人、啮齿动物、负鼠、鸟类和鱼类黏膜的体外粘附试验，结果表明该乳酸菌的粘附不具有宿主特异性，但具有种属特异性。

4 检测粘附的方法

检测粘附的方法多种多样 ，应用最普遍的是革兰染色法_8．3  J，但该法存在固有的局限性：不能区分同样着色的菌株，受主观因素的影响，误差较大 引，且该法不能区分死菌和活菌。平板计数法  也是检测粘附的一种方法，这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数，其最大的缺点是速度慢，需要平板上长出菌落一段时间后才能计数，且容易污染。放射性标

记法也是使用较多的方法l引，该法更准确也更简单，但是 cpm(counts—per—minute)比率不稳定，且放射性存在潜在危害需要特殊的实验设备也制约了该法的广泛应用。随着分子生物学的发展，以 ELISA 为基础的方法被认为是测定不同细菌对动物细胞粘附的方便可行的系统  柏。。目前这一方法已经成功 运用于链球菌对细胞系粘附的检测  和葡萄球菌对原代培养细胞粘附的检测H 。LE等 4 研究发现ELISA方法与放射性标记法相比能更好地研究细菌与细胞的粘附，应用特异性好的抗体时效果更明显，而且这一技术方便，可以同时处理大量样品。

5 粘附的生物学效应和作用

乳酸菌粘附定植于肠上皮细胞表面引起形态、功能和生理生化的变化，如：与其他厌氧菌一起构成生 物膜菌群起占位性保护作用，保护肠黏膜免受病原菌的入侵；同时通过产生有机酸、过氧化氢等抑制病原菌的生长繁殖，从而发挥生物学屏障作用。

5．1  形成占位性生物屏障，拮抗病原微生物 猪内源乳酸杆菌能 明显的抑制 ETEC K88对猪十二指肠的的粘附，降低达 50％左右，同时用耗尽培养上清液的透析保留物处理黏膜后也能抑制 ETEC K88的粘附，推测乳酸杆菌对肠黏膜的粘附发挥了占位保护作用 J。双歧杆菌能完全抑制 EPEC与ETEC的粘附，这种作用可能是由于双歧杆菌在空间上阻止了病原菌与 Lovo细胞的进一步接近 引。

5．2 信号传递  叶桂安等  定量研究了双歧杆菌 1027株、EPEC对体外肠上皮细胞 Lovo细胞株粘附 的钙信号传递机制。发现双歧杆菌粘附引起 Lovo细胞内ca¨升高主要源于细胞外 ca¨内流所致，与 EPEC粘附引起宿主细胞内 ca¨升高主要源于细胞 内 Ca¨储池的 Ca¨释放不同。EPEC粘附引起宿主 细胞内 Ca 大幅度升高是其致病的重要信号传递基础，而双歧杆菌粘附仅引起宿主细胞内 ca 轻度升 高，可能是其作为生理性细菌与肠上皮细胞和谐共生的信号传递基础，但其机制还不清楚。LIVEIN—LE—MOAL等 妁 的研究结果也显示嗜酸乳杆菌 LB可以有效地减少由腹泻性大肠埃希菌 C1845引起的肠上皮细胞微绒毛骨架的重排以及刷状缘骨架蛋白的异常表达和肠黏膜屏障通透性的增加。

5．3 保护宿主细胞 ，消除病原茵引起的形态学变化肺炎链球菌粘附于血管内皮细胞后，能引起宿主细胞的显著的形态学 变化，导致细胞的破坏。幽门螺杆菌粘附于体外培养的胃黏膜上皮细胞后，能刺激粘附部位肌动蛋白丝的聚合，引起细胞骨架改变，细胞表面微绒毛破坏和消失  。双歧杆菌能特异性地粘附于Lovo细胞的刷状缘，被粘附的Lovo细胞表面结构无破坏¨ 。这提示正常生理性细菌对宿主细胞的粘附与病原菌的粘附可能存在着本质上

的差别。

6 影响粘附的因素

乳酸菌粘附细胞的过程易受各种内外环境因素的影响 ，主要包括 pH、细菌动力、细菌自身凝集和疏水性 。

细菌的动力是影响细菌粘附的重要因素之一。

细菌粘附黏膜上皮细胞的过程不但取决于粘附素与受体间的相互作用，还取决于粘附素与受体间的接触机会，其中细菌的动力起着重要作用。EREZ[49 和 DEL  分别对双歧杆菌的粘附与自身凝集和疏水性进行了研究，根据自身凝聚力和疏水性不同把双歧杆菌分为具备粘附力 自凝株与不具备

粘附自凝株，具备自身凝集力和菌体表面疏水性高的双歧杆菌具有更高的粘附力。酸性环境可以促进双歧杆菌对 Lovo细胞的粘附，随着 pH下降双歧杆菌的粘附增强，pH 4．0时的

粘附数是 pH 7．4时的两倍 ，可见酸性环境是双歧杆菌粘附的促进因素。但其机制尚不清楚。

7 展望

乳酸菌对肠上皮细胞的粘附是其定植的前提，也是其发挥生物学作用的基础。乳酸菌的粘附是由乳酸菌细胞壁中的脂磷壁酸、细菌表面蛋白等粘附素与宿主细胞表面的受体相结合的过程，并且在粘附的过程中还受到环境因素的影响。乳酸菌粘附后通过形成生物学屏障，或是通过分泌的有机酸、过氧化氢等起到抑制病原菌，维持机体健康的效果。因此，研究乳酸菌的粘附机制，从基因和分子水平研究其粘附素和粘附素受体对于开发新型微生态制剂，改善微生态制剂的使用效果都具有重要意义。在生产中，筛选具有高粘附力的菌株，同时通过基因工程等方法提高益生菌的粘附力以延长菌株对肠上皮细胞的粘附时间，以及如何做到一次投喂，终身受益等问题都值得深入研究。